Under universitetsstudier i medie- och kommunikationsvetenskap på Boston College blev Amy Poehler medlem i ståuppkomedigruppen My Mother's Fleabag. Hon vidareutbildade sig i improviserad komedi vid ImprovOlympic, numera iO Theater, där hon träffade Tina Fey, som kom att bli hennes samarbetspartner både på scen och i flera TV- och filmproduktioner.