Goltzius gjorde sig först känd som kopparstickare med miniatyrporträtt som specialitet. Tillsammans med Karel van Mander och Cornelis van Haarlem grundade han 1583 i Haarlem en konstakademi, som särskilt ägnade sig åt studiet av människokroppens rörelsemönster. Efter 1600 utförde Goltzius också målningar, mest med intrikata allegoriska motiv. Goltzius många teckningar