Från 1561 gav Erik XIV Sture flera uppdrag av diplomatisk och militär art men började senare betrakta honom med stor misstro. År 1566 ställdes Sture inför Höga nämnden, anklagad för tjänsteförsummelse, och fick företa ett skymfande intåg i Stockholm. Likväl sändes Sture till Lothringen samma år för att utverka slutligt